PROTAC之后,分子胶降解剂能否迎来突破?

来源:未知 时间:2020-06-30 05:46:43 字体:[ ]

很众疾病都是由特定的致病蛋白积累引首,所以大无数药物清淡采用了「锁钥」设计理念,经由过程直接结相符在现在的蛋白的结相符口袋内以阻断其活性。然而,又存在很众蛋白,操纵这栽通例的设计手段无法达到靶向作用,吾们称为「不能成药」靶点,但随着PROTAC技术的崛首,稀奇是近期临床效果的公布,让吾们看到了靶向这些「不能成药靶点」的期待。不过,PROTAC靶向的众是胞内蛋白,对于大无数胞外蛋白又显得那么力不从心。

其实,细胞体内有着众栽蛋白降解途径,泛素-蛋白酶体只是其中一栽,此外还存在能够降解胞外蛋白的自噬、溶酶体降解等。近期,来自麻省理工学院、哈佛大学等机构的科学家们在Nature[1]上发外一栽新的分子胶降解剂CR8,经由过程剖析CR8的作用机理细节,钻研人员向吾们展现了如何构建更众这些稀奇的化相符物以行为众栽疾病的湮没治疗手段。

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CR8最初的设计是按捺在细胞滋长中首主要作用的,被称为细胞周期蛋白倚赖性激酶(CDK)的化相符物。钻研人员操纵他们的生物新闻学手段发现,CR8的细胞杀伤活性与E3泛素连接酶复相符物DDB1的程度有关。最先,为了判定经由过程E3泛素连接酶介导蛋白质降解的幼分子,钻研人员将经过578栽癌细胞系测试过的4 518栽临床和临床前药物的药物敏感性数据与499栽E3连接酶的各自mRNA程度相有关,采用CRISPR介导的E3连接酶成分失活来验证连接酶外达与药物毒性之间的有关性。在定量的蛋白质(超过8 000栽)中,细胞周期蛋白K是唯一在增补CR8后首终表现丰度降矮的蛋白质,CR8不会转折细胞周期蛋白K mRNA的程度,并且CR8诱导的细胞周期蛋白K降解能够经由过程按捺E1泛素激活酶(操纵MLN7243),按捺cullin腺苷化(MLN4924)和蛋白酶体(MG132)的按捺作用(图d)来拯救。这些外明,CR8经由过程含有DDB1的cullin-RING泛素的活性触发细胞周期蛋白K的迅速蛋白酶体降解(图e)。

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体外泛素化试验证实,仅CUL4A-RBX1-DDB1连接酶中央足以驱动细胞周期蛋白K的兴旺泛素化。在异国药物的条件下,体外仍可检测到CDK12-cyclinK与DDB1之间的弱相互作用,但CR8添强了复相符物的形成。相互作用的定量表现,CR8在100-500 nM的周围内刺激CDK12-cyclin K和DDB1之间的结相符,外明CR8参与的CDK12-cyclinK经由过程DDB1被召募到CUL4-RBX1-DDB1连接酶中央,并且CR8足够拉紧了复相符物,以驱动CR8诱导的cyclin K降解。

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其他团队曾钻研了一栽组织相通于CR8的药物,发现它不会导致细胞周期蛋白K降解。两栽化相符物之间唯一的组织迥异是特出的吡啶基化学片面。钻研幼组得出结论,该片面足以使CR8像分子胶降解剂相通发挥作用。该发现外明,按捺剂向外片面的化学修饰可将其变化为针对特定蛋白质靶点的分子胶降解剂。

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末了,为了检查与非降解CDK按捺相比,CUL4介导的细胞周期蛋白K降解如何添好CR8细胞毒性,钻研人员分析了野生型HEK293T-Cas9细胞,以及经预处理的能够会导致DCAF太甚外达或DDB1基因缺失细胞中的CR8毒性。效果表现,MLN4924周详按捺cullin-RING连接酶的活性仅对细胞活力产生较幼的影响,但导致对CR8的敏感性降矮,外明cullin-RING的酰化作用连接酶内心上有助于CR8毒性。底物受体CRBN的过外达也影响了细胞对CR8的敏感性,并降矮了细胞周期蛋白K的降解。正如预期的那样,CR8诱导的细胞周期蛋白K降解取决于DDB1,并且一致地,在匮乏DDB1的细胞中,CR8(而非其他CDK按捺剂)的细胞毒性要矮十倍。

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「吾们已经外明,能够采用通例的激酶按捺剂,并经由过程连接特定的化学基团,将其转化为分子胶降解剂,」该钻研的共同作者、Dana-Farber癌症钻研所医学肿瘤学系主任Benjamin Ebert说,「这挑供了创造分子胶降解剂的潜力,可用于比吾们最初预期的更普及的治疗现在的。」

这些发现外明,行使蛋白质-蛋白质界面的幼分子诱导的激酶失活,联系我们为改善药物选择性挑供了一条途径,表明修饰结相符靶标幼分子的表面袒露区域是一栽相符理的策略,可用于开发给定蛋白质靶标的分子胶降解剂。

看到这边,不禁令人想到不久前发外在JMC[2]的一篇文章,那时的钻研人员在钻研Bcl6按捺剂,却发现了可将Bcl6降解的化相符物。

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钻研人员操纵荧光偏振(FP)分析,采用高通量筛选中HIT化相符物2和3(外1),这些化相符物的效价较弱(IC50〜100μM)。原由较差的消融性窒碍了获得配体结相符的X射线组织,为晓畅决这个题目,进一步制备了具有亲脂性降矮的含较少芳香环相通物。化相符物4和5外现出与先前得到的化相符物相等的活性,并挑高了消融度(外1),从而能够确定X射线组织。

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经由过程对蛋白晶体的分析,发现化相符物在BCL6的BTB域的二聚体界面处结相符(图A和图B)。4和5共有两个相互作用特征:从NH到Met51的骨架羰基的氢键以及它们的氰基吡啶片面插入蛋白质表面上Tyr58和Asn21之间的缝隙中,从而在氰基吡啶和Tyr58的侧链之间产生关键的疏水相互作用。化相符物4经由过程其苯并咪唑酮核的氧原子与Glu115的主链NH和经水分子介导与His116的主链NH形成另外的相互作用。5的环丙基基团仅与残基53-55的骨架形成弱疏水相互作用,这外明5的氯氰基吡啶挑供了该化相符物的大片面结相符亲和力。

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所以,钻研人员倘若将苯并咪唑酮中央与5的氯氰基吡啶结相符操纵会导致效力增补。令人安慰的是,所得化相符物6(CCT365386)的结相符亲和力实在得到改善,挑高到10μM。此后,钻研人员不息针对挑高化相符物的效力和消融性进走钻研,然而,在钻研中却发现,化相符物24b处理的SU-DHL4和OCI-Ly1细胞,与化相符物介导的BCL6降解一致,蛋白质裂解物的Western分析外明BCL6蛋白程度呈浓度倚赖性降矮。

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鉴于上述图中R3位置差别的取代基外现的Bcl6降解能力,同时考虑到幼分子降解物的催化作用,无需对BCL6十足不息占有的必要,能够在较矮浓度的化相符物中便具有活性,所以钻研人员最先决定凝神于这栽新式BCL6降解物的优化,旨在判定具有正当理化和药代动力学特性的化相符物,最后发现了CCT369260。

经由过程对造成具有化相符物降解作用的哌啶基的蛋白结相符位置分析,他们发现该基团同样处于二聚体界面的表面袒露区域。

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钻研人员对这类分子促进蛋白降解的一栽有关湮没机制进走了推想,一栽能够是经由过程「疏水标记」,降解剂结相符现在的蛋白,并在表面上以「疏水性斑点」样式展现,模仿片面未折叠的蛋白状态,然后将其进走靶向降解。另外一栽倘若是蛋白质表面和降解剂的结相符形成了能够被E3泛素连接酶或其他蛋白酶体降解的效答子识别的「新底物(neo-substrate)」或「新降解子(neo-Degron)」。

这两篇文献挑示吾们,对分子在蛋白质-蛋白质界面或靶标结相符口袋表面袒露区域的组织进走修饰有看发现新的分子胶蛋白降解剂,但对于如何进走相符理设计、选取那些片段能够使幼分子按捺剂变化为降解剂照样是有待解决的题目。

有关论文:

[1] Mikołaj Słabicki et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K, Nature (2020). DOI:10.1038/s41586-020-2374-x

[2]Benjamin R.Bellenie, et al,. Achieving In Vivo Target Depletion through the Discovery and Optimization of Benzimidazolone BCL6 Degraders, DOI:10.1021/acs.jmedchem.9b02076

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